今日更新：环状 RNA （circRNA）引物（primer）设计和特异性检测

   circRNA引物设计随着近几年circRNA研究的崛起，越来越被重视，由于circRNA的结果特异性---环状结构，所以其PCR并没有普通mRNA农民简单，很有可能很多同志做出来结果都不满意，今天介绍一款circRNA引物设计软件，值得骄傲的就是国人在circRNA的研究确实处于前列，这个软件也是国人设计：

    文章原文：（可在附件下载）

    （CircPrimer: a software for annotating circRNAs and determining specificity of circRNA primers）

https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-018-2304-1

   软件链接：

http://www.bioinf.com.cn/

    软件介绍：

    软件首页

    软件功能

    （1） 注释环状 RNA 的外显子和内含子构成

    （ 2）图形化注释环状 RNA 序列在亲本基因中的功能

    （ 3） 检索 circBase 中的环状 RNA

    （ 4）获得环状 RNA 的剪切序列和基因组序列

    （ 5）辅助设计环状 RNA 背靠背引物

    （ 6）辅助设计环状 RNA 引物跨剪切位点的引物

    （ 7）测验引物的特异性

    （ 8）图形化显示引物在环状 RNA 中的位置

    （ 9）将序列转换为反向互补、反向和互补序列

CircPrimer is a user-friendly tool for exploring circRNAs that does not require special user skills. CircPrimer enables users to extract the spliced sequences and genomic sequences of any circRNA, including novel circRNAs. Furthermore, circPrimer help users to design primers for circRNAs and to determine the specificity of the circRNA primers.

    具体使用步骤如下：（具体步骤可在附件下载）

    引物测验目的和原理
    来源于一个亲本基因的环状 RNA 可能含有相同的序列，例如 SATB2 基因由12 个外显子构成，这些外显子及其内含子可以形成 53 种不同的环状 RNA。比如， hsa_circ_0118561 由 SATB2 的外显子 9 和 10 环化而成，而 hsa_circ_0057685由 SATB2 基因的外显子 9、 10 和 11 环化而成（如下图）。为 hsa_circ_0118561 设计的背靠背引物必然会扩增 hsa_circ_0057685（图 12B 和 12C），通过 circPrimer软件可以检测设计的引物可以扩增多少个环状 RNA 以及他们的扩增片段有多大，如果目的片段很小而干扰片段特别大时可以通过缩短扩增时间来排除干扰。或者，通过设计跨剪切点的引物来排除干扰，如图 12D 所示。不过需要特别注意的是，如果跨过剪切点的碱基过多时（≥5） 会导致 SATB2 mRNA 以及其它一些含有外显子 10 的环状 RNA 都会被扩增，这是因为引物只要 3’段跟模板结合即可合成下游序列。 因此， 引物 3’端跨过剪切点的碱基要控制在 1~4 个之间，跨过剪切点的碱基越少越好。

    设计步骤：

    以 hsa_circ_0057691 为例设计背靠背引物

    点选“ Divergent primer”引物，然后点击“ Template”按钮，软件会自动将环状 RNA 序列从中间分开并将两段序列位置互换，通过符号“ [”和“ ]”框定接头处碱基来告知 Primer3 产物要包括该接头。此时模板序列已经拷贝到粘贴板中，点击软件 Primer3 (V4.1)链接，粘贴模板序列，并将 Product Size Ranges 改为 50-100（荧光定量 PCR 扩增片段最大不可超过 250），然后点击“ Pick Primers”按钮

      设计跨环状 RNA 引物剪切点（ backsplice junction）的引物

      以 hsa_circ_0057691 为例设计跨环状 RNA 剪切点的引物
    点选“ One primer spanning junction”，然后点击“ Template”按钮，软件会自动将环状 RNA 序列从中间分开并将两段序列位置互换，通过在两段序列中间添加符号“ -”来告知 Primer3 (V4.1)引物要跨该序列区。点击软件 Primer3 (V4.1)链接，粘贴模板序列，并将 Product Size Ranges 改为 50-100（荧光定量 PCR 片段最大不可超过 250），然后点击“ Pick Primers”按钮

  如果得不到合适的引物，则按照图 9 更改参数后再点击“ Pick Primers”按钮。

    测验引物的特异性

    在软件右上角输入要检测的引物，如下图 所示，点击“ check”按钮。因为要检索的环状 RNA 序列较多，因此需要较长时间完成测验（ <1 分钟）。下图①处的数字 9 表示该引物可以扩增 9 个环状 RNA，②处的列表显示了 9 个环状RNA 的 ID、基因符号、扩增产物大小以及引物特征（列名为 F0R）。 F0R 列中的数据如果是 0 表示该引物是背靠背引物（ divergent primer），如果是 1 表示该引物是线性扩增引物（ convergent primer），如果显示的是“ F 或 R+数字”的形式，表示引物跨环状 RNA 的剪切位点， F 表示上游引物， R 表示下游引物，数字表示跨过剪切位点的碱基数。如下图所示 hsa_circ_0057691 的 F0R 是“ R 3”表示下游引物有 3 个碱基跨过了剪切位点

• CircPrimer中文说明书.pdf(912.95k)


• CircPrimer.pdf(1569.28k)

居然还被你看出来我是重庆的了，厉害了。

你是预测miRNA和lncRNA哈？

lncRNA理论上是可以作为miRNA的“海绵”，可以发挥竞争性抑制作用，导致miRNA活性低，而其靶基因表达增高。

这个海绵作用，主要是通过二者的序列来预测，从而验证。

一般来说，每个lncRNA肯定是有不少海绵miRNA的，starbase这个软件现在有些功能是被限制了，用不了，我还发邮件问了杨教授是什么情况，也没有回复，估计是买给某个公司之类的。

所以你用多几个软件试试，理论上肯定找得到，如果实在没有，那也没有办法了。

我给你推荐两个软件，应该可以满足你的要求：

第一个，lncrnamap，这个软件可以详细显示miRNA和lncRNA的关系，并进行了详细标注：

比如我想查找XIST的相关miRNA：

第二个，LncACTdb：LncRNA-associated Competing Triplets DataBase 

这个软件更厉害吧，是哈尔滨医科大学的研究员弄的，看看他们自己的介绍：

a compilation of lncRNA-miRNA-mRNA interactions and annotated human lncRNAs with computationally predicted or experimentally supported miRNA regulatory interactions and miRNA targets. Human lncRNAs compete with target mRNAs for miRNAs in RNA-RNA crosstalk networks to regulate mRNA through a post-transcriptional mechanism. Competition based lncRNA-miRNA-gene interactions are defined as lncACTs and are prevalent in humans and other species. The LncACTdb was created in order to provide a comprehensive lncACT compendium and facilitate the study of lncRNA function.

可以根据miRNA来观察其可能有关lncRNA，也可以根据lncRNA来观察miRNA，还有直接根据基因来观察可能有关的miRNA和lncRNA等。而且操作简单，直接选择即可：

比如可以根据miRNA来观察其可能有关lncRNA和基因：

比如根据lncRNA来观察miRNA和基因：

比如直接根据基因来观察可能有关的miRNA和lncRNA：

你可以都试试。